Temel prensip, çoğu molekülün, spektrumun morötesi ve görünür bölgelerinde (185 ila 700 nm) belirli bir dalga boyu aralığında ışığı absorbe etmesidir. Bir spektrofotometre, ışıktan bir dalga boyu bandı seçmek için bir ışık kaynağı, bir monokromatör veya filtreden oluşur ve bu daha sonra bir dedektör tarafından ölçülmeden önce bir hücredeki (küvet) bir çözelti boyunca parlatılır. Emilen ışığın oranı, solüsyondaki bir analit seviyesini elde etmek için kullanılır.

Bir analit tarafından bir numuneden geçerken emilen belirli bir dalga boyundaki ışık miktarı, analitinkonsantrasyonu ve çözeltiden geçen ışığın yol uzunluğu ile orantılıdır. Genel olarak, standart çözeltiler tarafından emilen ışık ölçülür ve kalibrasyon grafiğinden numunenin konsantrasyonu belirlenir. Emme bantları oldukça geniş olduğundan, diğer bileşenlerle örtüşme olabilir. Bunu telafi etmek için, okumaları düzeltmek için bir yoğunluk oranları seçimi ve arka plan düzeltmeleri geliştirilmiştir.